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人类体外受精胚胎移植实验室操作专家共识

来源:    更新时间:2018-11-06

  体外受精胚胎移植(IVF-ET)技术已在我国大陆地区发展27年,近15年来,该项技术迅速成长,大批生殖中心在各地陆续建成。2001~2003年,卫生部主管部门颁布了一系列针对辅助生育技术的技术规范及管理办法,使得该项技术走向规范化,得到健康发展。2005年12月,中华医学会生殖医学分会(CSRM)成立,进一步促进了该学科的学术发展。

  近些年来,中华医学会生殖医学分会各方面专家在临床、实验室方面均积累了丰富的经验,形成了独特的见解。为了进一步规范IVF实验室操作,为患者提供更优质的临床医疗服务,学组根据国内外发表的文献和国内实验室专家意见,并参考了美国生殖医学协会和欧洲生殖医学会的相关指南,制定本指南。

  由于专业的特点,目前国内外的临床胚胎实验室相关指南大量观点证据级别均较低,或者无循证证据。因此按照CSRM指南共识编写手册的分类,本指南为正式的专家共识指南。

  本指南的适用范围为我国已经正式实施IVF-ET技术的生殖中心,在为不育患者实施IVF-ET治疗中,临床胚胎学家进行的人类配子和胚胎操作。制定本指南的目标是协助各个实验室制定自己的标准操作程序,从而获得更加稳定的临床结局,减少差错发生。

  IVF-ET实验室操作的关键问题
 


 

  一、配子与胚胎的总体操作原则

  IVF实验室内负责管理工作的临床胚胎学家,应该针对所有配子或胚胎进行的操作制定标准操作程序,并应该按照该标准操作程序培训下级临床胚胎学家。

  所有操作方法应该简便、安全、可靠。胚胎培养室还应遵循无菌、无毒、无味、无尘的原则。

  新装修胚胎培养室启用前需要做鼠胚试验,鼠胚试验合格后才能投入使用。胚胎培养室还应该有 UPS电源,以保障24h不间断供电。

  除冷冻复苏等特定操作外,操作与观察过程应该保持配子或胚胎处于37℃的温度、40%~60%湿度的环境下。

  IVF实验室内的空气质量情况会明显影响胚胎的发育潜能,建议采取适当的措施改善实验室的空 气质量,特别是能够去除空气中VOC的净化系统。

  所有操作应该符合无菌原则;所有配子或胚胎操作应该在百级洁净区域内进行。

  所有配子或胚胎的培养皿、试管等应该在放入配子或胚胎前标注患者姓名。不应该在同一操作区 域内同时操作两位或多位患者的配子或胚胎。应该将一位患者的样本完全处理完并放置入培养箱或液氮容器后再处理下一位患者的样本。不同的容器间转移配子或胚胎前,应该核对两个容器上的患者姓名标识。

  所有接触患者配子或胚胎的耗材、试剂需要经过精子存活实验后方可使用,有条件者建议进行鼠 胚试验。

  所有接触患者配子或胚胎的耗材(培养皿、巴斯特管、吸管、加样器头、取卵针、移植管等),只能一次性使用,使用后按医用垃圾处理。

  对配子或胚胎进行的操作时应该进行双人复核。

  具体的每一步操作过程,应该有纸质和电子记录保存,以备日后查验。

  详细记录每个病人所用的试剂、耗材批号。
 


 

  二、取卵及捡卵

  IVF实验室的胚胎学家在取卵前应与临床医生核对患者信息,在临床医师对患者实施取卵术时,应 该同步进行捡卵操作。

  由于卵母细胞在长时间处于低于体温的环境下受精能力将下降,非整倍体几率增加,因此,在取卵过程中,应从患者卵巢内抽出的卵泡液应由负压吸引器直接吸入37℃恒温试管架上的无菌试管中。取出的卵泡液应该保持在37℃左右的环境下,尽快在体视镜下识别卵冠丘复合物,通过轻柔吹打、洗涤的方法去除卵冠丘复合物周围的血液、血凝块和卵泡液成分。

  以尽可能减少开启培养箱次数、尽可能缩短在培养箱外停留时间为原则,将卵冠丘复合体移至培养箱,记录所用培养液批号、取卵者及拣卵者姓名、培养箱号、卵冠丘复合物形态评估情况以及捡卵核对者的姓名等。

  三、精液处理

  所有患者夫妇在进行IVF治疗之前,应该进行精液常规分析,分析推荐采用WHO第5版的标准。

  除特殊情况外,男性配偶应该在取卵前2-7d排精一次。精液收集在无菌、无毒性的取精杯中,并在取精杯上注明患者夫妇姓名及编号。取精后尽快将取精杯送入精液处理室,建议在1h内开始处理。

  精液处理应该在室温下进行。精液处理的目的是去除精浆以及精液中的污染物、杂质和异常精子,并使精子获能。精液处理过程中应该记录取精方法、精液的量、颜色、液化情况等基本参数。如院外取精,或者在采集精液过程中发生特殊情况,应该予详细记录。

  目前暂无统一的精液处理方法,可根据各中心经验和精液样本质量选择优选方法。不管采用何种方法,反复长时间离心可能会导致精子的损伤。

  处理过程(每步时间、操作者等)及处理后的精子浓度、活率,应该记录备案。


 

  常用精液处理方法为密度梯度离心法或上游法,但对浓度极低的精液样本,建议仅洗涤1-2次后备用,以卵胞浆内单精子注射(ICSI)方式授精。

  1.液化不良精液处理 :对液化不良的精液,建议在离心前,用无菌注射器吹吸混匀,或巴氏吸管反复吹打混匀,混匀后让未液化团块自然沉淀后弃去,再对样本进行密度梯度离心。

  2.上游法 :上游法处理精液,推荐直接将原精液样本置于培养基下层,收集上层悬液。不建议先与培养基混匀离心后再上游的处理方式。

  3.密度梯度离心法 :相对上游法处理精液,密度梯度离心处理后精子的回收率较高。上游法和密度梯度离心法都会显著降低凋亡精子的比例。

  四、自然受精

  1.自然受精的加精时间 :HCG注射后38-40h加精,受精率较为理想。加精时应该双人核对并记录时间、加精量。

  加精浓度在很大的一个范围内,获得的受精率类似,在30-50ul的液滴内加精5000-10000条,或在1ml的培养液内加精15万-30万条。但过高的加精浓度可能导致多精受精率升高和培养体系生化环境下降,因此可能有害。

  2.精卵共培养时间 :常规受精:将精卵共培养18-20h;短时受精:缩短精卵共培养至1-6h(短时受精仅指缩短共培养时间,不包括剥除卵冠丘复合物的颗粒细胞)。

  短时受精缩短了精子与卵母细胞共培养的时间,能够改善临床妊娠率。短时受精周期中,多原核发生可能与患者年龄有关。短时受精周期中,多原核发生率对临床妊娠结局的影响尚不明确。与常规受精相比,短时受精的可移植胚胎率及优质胚胎率更高 。
 


 

  五、ICSI

  ICSI适应症 :除了原卫生部颁布的《卫生部关于修订人类辅助生殖技术与人类精子库相关技术规范、基本标准和伦理原则的通知》中的适应症之外,对于前次IVF多精受精比例较高、没有获得足够可移植胚胎的患者,再次治疗可以考虑ICSI。

  解冻睾丸精子行ICSI,能得到与新鲜睾丸精子类似的受精结局。

  ICSI之前需要用透明质酸酶和机械的方法去除颗粒细胞,在此过程中,应该尽量减少卵子接触酶的时间,机械去除颗粒细胞的过程中应该使用适当口径的巴斯特管,尽量减少吹吸次数,从而减少机械刺激的应激。

  透明带明显异常的卵母细胞自然受精能力下降,采用ICSI方式授精能明显改善受精结局 。

  在经过常规卵巢刺激后,获得的未成熟卵母细胞常常存在染色体异常,未表明对这些卵进行ICSI能改善结局 。如经过卵巢刺激获卵均为MI期停滞的卵细胞,行体外成熟培养(IVM)结局不良 。

  HalfICSI :部分卵子ICSI(HalfICSI)作为可疑受精困难者的备选,在一定程度上预防IVF完全受精失败。

  ICSI操作过程中,可以考虑采用PVP等液体来降低操作难度,但要尽量减少注入卵母细胞的 PVP的量。
 


 

  影响ICSI受精率的最重要的因素 包括:卵母细胞的质量和成熟度、精子质量及制动情况、破膜的情况。

  在操作人员技术熟练的基础上,受精率低或卵母细胞退化率高的最可能原因是卵母细胞的质量差或成熟度不良 。应该尽一切可能选择活动精子制动后注射,制动过程如果不充分(未划破精子尾部细胞膜)将影响受精率。

  如全部精子均为不动精子,可以考虑在ICSI操作中使用睾丸精子、经低渗处理的精子或者在精子中加入精子激动剂 ICSI后应该在记录中记录卵母细胞和精子的情况、操作过程、操作者、所用培养液及耗材详情。

  六、早期补救性ICSI

  短时受精结合早剥除卵冠丘复合物颗粒细胞(早拆卵),以极体排出(卵子激活)判断受精发生,如卵子激活完全失败或卵子激活发生率低于一定比例时,在加精时间短于8h行补救ICSI称早期补救ICSI。

  短时受精(早拆卵)联合早期补救性ICSI对常规IVF周期完全受精失败患者的临床结局有明显改善 ,早期补救ICSI后妊娠的出生结局及新生儿状况与采用射精精液的ICSI后出生结局无统计学差